具有致病性线粒体DNA (mtDNA)点突变的患者通常会出现致残性神经系统综合征，导致严重残疾和过早死亡^[1]。至少有1/5000的人口受到mtDNA疾病的影响^[2]。线粒体遗传疾病的单核苷酸多态性(SNP)通常存在异质性^[3]，即：野生型和突变型共存。突变异质率不同的个体表现出不一样的临床症状^[1]。同质的mtDNA突变可以很容易地在血液中检测到。然而，对于异质突变，突变mtDNA的百分比水平因组织而异，并且在同一个体中也可能随时间而变化(例如，导致Leber遗传性视神经病变(LHON)的m.11778A>G)。因此SNP异质率的精确检测对线粒体遗传疾病的诊断至关重要。最近，基于CRISPR的分子诊断技术因其特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点受到广泛关注^{[4, 5]}。例如，巢式RPA和CRISPR/Cas12a辅助病毒鉴定的多重分析平台(MAPnavi)被用于快速(< 40分钟)诊断多种呼吸道病毒^[6]。然而，这些单信号输出方法难以准确诊断mtDNA疾病的异质性水平，因为结果受到样本中模板总量的影响。与基因组SNP基因分型不同，mtDNA疾病的异质性水平诊断需要更准确的SNP丰度定量，这仍然是一个挑战。

化学与环境工程学院刘翼振副教授团队在生物传感器顶级期刊《Biosensors and Bioelectronics》上发表了题为“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究，2022级化学专业硕士研究生吴小龙为第一作者，陈勇副研究员和刘翼振副教授为共同通讯作者，深圳大学为唯一通讯单位。

Link: https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676

该研究提出了一种自动化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片传感器(RatioCRISPR)，用于准确量化线粒体疾病SNP的异质性水平：首先，从mtDNA疾病患者的血液样本中提取DNA。然后与RPA扩增试剂混合，从样品孔中加入到芯片。之后，芯片将按照预设程序自动运行(图1a)。而后，采用比率信号输出的方法，提高了稳定性，最大限度地减少了样品浓度对异质性水平检测的影响，使诊断结果只与模板中野生型和突变型的相对含量有关。最终RatioCRISPR实现了在25分钟内同时准确地检测8个样品，检出限(LOD)为15.7 aM。并成功检测了3种mtDNA点突变(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13个模拟样本，这些突变导致Leber遗传性视神经病变(LHON)^[8]，并设定了异质性阈值(60%)来评估疾病风险。这种自动化、精确的生物传感器在诊断多个SNP，特别是具有异质性的SNP具有广泛的应用，为遗传咨询、流行病学研究和多种异质SNP疾病提供了一个快速、经济、实时的临床诊断平台。

图1  RatioCRISPR用于mtDNA疾病诊断的示意图。

作者提出了一种通用的、自动化的RPA-CRISPR/Cas12a比率测定芯片(RatioCRISPR)，用于mtDNA疾病的诊断。作者首次尝试在基于CRISPR/Cas的生物芯片中引入比值信号输出方法，实现SNP相对丰度的精确定量。该平台具有以下优点:1）建立比率型信号输出系统来量化异质性水平，使样品浓度的影响减小。2）集成式封闭芯片设计，避免气溶胶污染，实现多路自动化检测。这种先进、便捷的生物传感器具有通用性、自动化程度高、准确度高等特点，在诊断多个SNP，特别是具有异质性变异的SNP方面具有良好的实用性和市场应用前景。